KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN HUYỆN CẦN GIỜ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Nấm sợi và khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi
1.1.1. Đặc điểm của nấm sợi [6].
Nấm sợi là những vi sinh vật có nhân chuẩn thuộc nhóm vi nấm, được phân bố
khắp nơi như đất, nước, không khí, sản phẩm từ sinh vật, bản thân các sinh vật kể cả
con người.
Nấm sợi sống kí sinh ở động, thực vật hoặc hoại sinh trên chất hữu cơ từ xác
động, t
hực vật, chúng là loài hô hấp hiếu khí bắt buộc, không chứa diệp lục tố, không
có khả năng quang hợp [13].
Nấm sợi là VSV ưa mát (Psychrotroph), có nhiệt độ tối ưu khoảng 25
0
C,
nhưng cũng có thể thích nghi với 0
0
C. Nấm sợi sống trong môi trường có pH hơi axít
đến trung tính (pH 3- 6). Mặc dù sự sinh trưởng của nấm sợi không cần ánh sáng
nhưng ánh sáng lại có tác dụng hình thành bào tử, tổng hợp sắc tố [8].
1.1.1.1. Hình tháí, cấu tạo [54].
Nấm sợi có cấu tạo sợi, phân nhánh hoặc không phân nhánh, có vách ngăn
ngang hoặc không có vách ngăn ngang. Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân
nhánh, bên trong chứa chất nguyên sinh có thể lưu động. Về chiều dài chúng có sự
sinh trưởng vô hạn (nhưng về đường kính thì
thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-
30µm thông thường là 5-10 µm).
Sợi nấm chỉ tăng trưởng ở ngọn
,
vừa dài ra không ngừng phân nhánh và vì vậy
khi một bào tử nẩy mầm trên một môi trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi nấm,
sau 3-5 ngày có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc (colony).

Tùy
theo môi trường cơ chất mà hệ sợi nấm sẽ phát triển thành các dạng khác nhau.

Vào
giai đoạn cuối của sự phát triển, khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa
các khuẩn ty với nhau, làm cho cả khuẩn lạc là một hệ thống liên thông mật thiết với
nhau, thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm. Hiện
tượng kết mạng thường gặp ở nấm bậc cao nhưng lại ít gặp ở các sợi nấm
dinh


dưỡng của nấm bậc thấp. Hình thái, kích thước màu sắc, bề mặt của khuẩn lạc…có ý
nghĩa nhất định trong việc định tên nấm.


Hình 1.1.
Sự phát triển của hệ sợi nấm
[55]. Hình 1.2.
Hình thái khuẩn lạc.





Hình 1.3. Các loại sợi nấm [54]


Hình 1.3. Các loại sợi nấm [54].
Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone).
Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng thành tế bào phát triển nhanh chóng,
vùng này có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh
trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào.
Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có kết cấu gấp nếp hay xoăn lại, người ta
gọi là biên thể m
àng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome). Nhiều khi chúng
có tác dụng tiết xuất các chất nào đó. Các chất dự trữ thường gặp ở nấm là glicogen,
hạt volutin, các giọt mỡ [51].
Nấm sợi chỉ mọc tốt trong môi trường có nhiều không khí, vì thế chúng phát
triển trên bề mặt cơ chất (khuẩn ty khí sinh) tạo thành lớp hình sợi, lớp mạng nhện
hay lớp sợi bông. Một số sợi nấm sinh trưởng bằng cách đâm sâu vào cơ chất và hút

chất dinh dưỡng (khuẩn ty cơ chất). Bên trong khuẩn ty có một nhân, hai nhân hay
nhiều nhân [9].

Vách
ngăn
Thành
TB
Sợi nấm có vách ngăn
Sợi nấm không vách
ngăn

Nhân
Nhân
TBC
TBC


Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm, sợi nấm mang sắc tố tạo
nên màu tối hay màu sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài môi trường và
làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo
nên các tinh thể trên bề mặt khuẩn lạc. Vì bào tử của nấm thường có màu nên cả
khuẩn lạc thường có màu [54]
.
Nấm sợi có cấu tạo của một tế bào có nhân thực, gồm ba thành phần cơ bản
của cơ thể sống: thành tế bào, nguyên sinh chất, nhân. Màng tế bào có cấu tạo bởi
cellulose hoặc các chất gần giống cellulose. Màng có cấu trúc đặc trưng từng loài.
Không có diệp lục nên nấm sợi không có khả năng quang hợp.
Trong tế bào nấm còn có các cơ quan như ty thể (mitochondrion), mạng nội
chất (endoplasmic reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus),
thể ribôxôm
(ribosome), bào nang (vesicle), thể Golgi sinh (Golgi body, Golgi apparatus,
dictyosome), các giọt lipid (lipid droplet), các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường
kính 0,5-1,5 nm (microbody), các thể Vôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body),
thể Chitôxôm đường kính 40 -70nm (chitosome)… Ngoài ra trong tế bào chất còn có
các vi quản rỗng ruột, đường kính 25nm (microtubule), các vi sợi đường kính 5- 8 nm
(microfilament), các thể màng biên (plasmalemmasome).

Hình 1.4. Cấu trúc sợi nấm [54].
Không bào
Sợi nấm Vùng kéo dài
Thể Golgi
Màng Tế bào Thành Tế bào
A. Nucleic
Ti thể
Màng nhân


1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa.
Nấm sợi là những sinh vật dinh dưỡng hóa năng hữu cơ, thuộc loại hoại sinh.
Để thực hiện các quá trình sinh lý khác nhau nấm sợi thường có những nhu cầu
không giống nhau về các nguồn thức ăn cacbon. Chúng có thể sử dụng nhiều nguồn
thức ăn khác nhau từ cacbonhydrat, amino acid đến amonia. Sự thích hợp của một
nguồn gốc thức ăn cacbon nào đó có thể được đánh giá bằng nhiều chỉ tiêu khác
nhau như mức độ si
nh trưởng tối đa của hệ sợi nấm, mức độ hình thành tối đa số
lượng bào tử, mức độ tích lũy tối đa các chất chuyển hóa. Sự sinh trưởng tối đa của
hệ sợi nấm thường không phù hợp với sự tích lũy tối đa các sản phẩm trao đổi chất.
Hầu hết các loại nấm sợi có thể đồng hóa trực tiếp mantose, lactose, melibiose, rỉ
đường [12].
Các loài nấm sợi khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau đối với nguồn t
hức ăn
nitơ, chúng sử dụng cả nguồn nitơ hữu cơ lẫn vô cơ. Nhiều loài nấm sợi (thuộc các
chi Aspergillus, Penicillium) có khả năng khử nitrat hóa. Một số loài như Aspergillus
flavus, Trichoderma lignorum, Myrothecium verrucaria… có khả năng đồng hóa
trực tiếp nitơ phân tử [12].
Các nguyên tố vi lượng có liên quan mật thiết với các quá trình xúc tác sinh
học trong tế bào nấm sợi. Các loại nấm sợi có quan hệ rất khác đối với các loại
vitamin và các chất sinh trưởng. Nhu cầu về chất sinh trưởng của một loài nấm sợi có

thể thay đổi tùy theo điều kiện nuôi cấy, tùy theo tuổi giống [12].
Ngoài các chất dinh dưỡng nấm sợi cũng như tất cả các sinh vật khác còn có
nhu cầu về nước cho các họat động sinh l
ý, sinh hóa của tế bào. Liên quan đến lượng
nước còn có độ ẩm. Các yếu tố này ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và quá trình
sinh trưởng, phát triển của chúng (độ ẩm không khí không thấp hơn 60 %). Khả năng
hấp thụ hay thoát nước của nấm đều liên quan với nhiệt độ môi trường, khoảng từ
15- 30
0
C, tăng trưởng tối ưu trong khoảng 25 - 30
0
C, tùy loài [12].
Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm
sợi rõ rệt là pH, bình thường chúng tăng trưởng ở pH = 6. Môi trường kiềm hoặc
acid, thì nấm sợi không hoặc tăng trưởng rất yếu [12]. Riêng các loài Trichoderma
thường xuất hiện ở đất ưa axít, phát triển tốt ở bất cứ pH nào nhỏ hơn 7 và chúng có
thể phát triển tốt ở đất kiềm nếu ở đó có một lượng lớn CO
2
và bicacbonat [22].


1.1.1.3. Phương thức sinh sản.
Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử mọc ra từ sợi nấm và sau đó là
hệ sợi nấm. Bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính hoặc hữu tính. Chúng khác
nhau về hình dạng và cách phát sinh.
* Sinh sản vô tính: Có 3 loại bào tử vô tính:
+ Bào tử động (zoospores)
+ Bào tử kín (sporangiospore)
+ Bào tử trần (conidi): loại bào tử phát sinh bằng con đường ngoại sinh hay nội
sinh, khi chín được giải phóng ra ngoài. Bào tử trần có thể có hoặc không có vách
ngăn ngang (Aspe
rgillus spp, Penicillium spp ), có một vách ngăn ngang
(Trichothecium spp…) có từ hai vách ngăn trở lên (Fusarium spp ), có vách ngăn
ngang lẫn vách ngăn dọc xen kẽ hay nối tiếp nhau (Alternaria spp…) Hình dạng bào
tử hình trứng, cầu, hạt chanh [51].
* Sinh sản sinh dưỡng: sinh sản bằng khuẩn ty hoặc bằng hạch nấm, đây cũng
là hình thức sinh sản vô tính.
* Sinh sản hữu tính:
+ Phương pháp đẳng giao, dị giao, noãn giao.
+ Bào tử tiếp hợp (zygospores)
+ Bào tử túi (ascospores)
+ Bào tử đảm
(basidiosppores)
Phương thức sống của nấm sợi: dị dưỡng, phần lớn hoại sinh, một số sống ký
sinh trên người, động thực vật, còn một số khác thì sống cộng sinh.

















Hình 1.5. Sự tiếp hợp của nấm sợi [54].

a b
Hình 1.6. Dạng bào tử kín Hình 1.7. Dạng bào tử trần của nấm sợi.(a-b)
1.1.1.4. Phân loại nấm sợi.
Vi nấm là thuật ngữ dùng để chỉ tất cả các loại nấm hiển vi (nấm men và nấm
sợi) không sinh quả thể lớn (mũ nấm).Việc phân loại vi nấm nói chung và nấm sợi
nói riêng vẫn đang ở thời kì phân loại học hình thái dựa vào các đặc điểm hình thái
nuôi cấy, một số đặc điểm
sinh lý sinh hóa và phương thức sinh sản. Các phương
pháp sinh hóa và sinh học phân tử được sử dụng ít trong phân loại vi nấm.
Nhà nấm học Italia P. A. Saccardo (1845-1920) đã chỉnh lý các nghiên cứu về
nấm và biên soạn bằng tiếng La Tinh 25 tập Kỷ yếu nấm. Các thành tựu nghiên cứu
đã được tổng kết khá đầy đủ trong 5 tập sách Giới nấm (The Fungi) của G. C.
Ainsworth và cộng sự (Vol 1, 2.3.4A.4B. New York and London: Academic Press,
1963-1973). Năm 1995 đã tái bản lần thứ 8 cuốn Từ điển về nấm (Dictionary of the
Fungi) của Ainsworth và Bisby. Nấm được chia thành 4 ngành (Division, Phylum
):
- Ngành Chytridiomycota


- Ngành Zygomycota
- Ngành Ascomycota
- Ngành Basidiomycota.
Các loài nấm không tìm thấy (đúng ra là chưa tìm thấy) dạng sinh sản hữu tính
được xếp chung vào nhóm Nấm bất toàn – Fungi imperfecti. Theo hệ thống phân loại
của Saccardo (1880,1886) thì các nấm này được xếp thành một lớp- Lớp
Deuteromycetes. Khi phát hiện thấy cơ quan sinh sản hữu tính thì người ta đổi tên
loài và xếp sang các lớp khác. Ví dụ nấm lúa von trước kia được gọi là Fusarium
moniliforme, nhưng sau khi tìm thấy cơ quan sinh sản hữu tính thì lại chuyển thành
loài Gibberella fujik
uroi. Các Nấm bất toàn hiện được xếp trong các nhóm conidial
Ascomycetes hay conidial Basidiomycetes.
Nấm bất toàn (Deuteromycota), nấm đảm (Basidiomycetes), nấm túi
(Ascomycetes) được xếp vào nhóm nấm bậc cao (Michael J.Carlile et al, 2001). Nấm
bất toàn là giai đoạn vô tính (Anamorph) của nấm túi hoặc nấm đảm.[55]
Khóa phân loại đến lớp (Robert A.Samson, 1984) :
1. Lớp nấm túi (Ascomycetses): bào tử sinh ra trong túi bào tử.
2. Lớp nấm tiếp hợp (Zygomycetes) bào tử kín sinh ra trong các nang bào tử
kín, hệ sợi không có hoặc có ít vách ngăn.
3. Lớp nấm bất toàn
(Deuteromycetes) : sợi nấm có vách ngăn, bào tử trần.
Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của
Hughes (1953). Lớp nấm bất toàn được chia thành 3 nhóm:
- Nhóm Hyphomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa giá (giá
sinh bào tử trần ở trên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó giá).
- Nhóm Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá, giá bào
tử trần ở tr
ong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata [16].
- Nhóm Agonomycetes : gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần.
4. Lớp nấm đảm (Bacidiomycetes) : sợi nấm có vách ngăn, sinh sản vô tính số
ít bằng bào tử trần, chủ yếu bằng bào tử đảm [54].
Người ta cho rằng trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm
nhưng mới định tên được khoảng 10 000 chi và 70 000 l
oài, Trung Quốc đã điều tra
được 40 000 loài. Riêng các loài nấm thuộc Nấm bất toàn ở nước ta hiện mới chỉ phát


hiện được 338 loài thuộc 306 chi khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004). Bảo tàng giống
chuẩn vi sinh vật (VTCC) thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Quốc gia Hà
Nội hiện đang hợp tác với Viện NITE (Nhật Bản) điều tra nghiên cứu khu hệ vi nấm
ở Việt Nam và có nhiều khả năng tìm thấy những loài mới trong quá trình nghiên cứu
[54].
Hiện tồn tại nhiều hệ thống phân loại nấm không thống nhất với nhau, có nhiều
khóa phân loại đã được sử dụng như: Saccardo P A (1880- 1886), Barron G.L (1968)
Barnett H.L và cộng tác viên (1972), Ainsworth G C (1973), V.Arx (1981), Bùi
Xuân Đồng (1984), Alexopoul
os & Mins (1996), Nguyễn Lân Dũng (2000), Đặng
Hồng Miên (1999), Nguyễn Đức Lượng (2003), Persoon ex Gray (1801). Sự phân
loại vi nấm đang ở thời kỳ phân loại học hình thái (Phenetic clasifications) và đã bắt
đầu dựa vào sự phát triển của sinh học phân tử.
Trong luận văn này, chúng tôi dựa vào đặc điểm mô tả trong các khóa phân
loại: Nguyễn Lân Dũng (2000)(trong tài liệu này có khóa phân loại của Saccardo P A
(cải tiến), Barnett H.L và cộng tác viên (1972)), Bùi Xuân Đồng (1984), Nguyễn
Đức Lượng (2003), Đặng Hồng Miên (1999).
1.1.2. Chất k
háng sinh từ nấm sợi.
1.1.2.1. Những đặc điểm cơ bản về chất kháng sinh.
* Chất kháng sinh được hiểu là chất hóa học xác định, không có bản chất
enzym, có nguồn gốc sinh học (trong đó phổ biến nhất là từ vi sinh vật) với đặc tính
là ở ngay nồng độ thấp (hoặc rất thấp) đã có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt
một cách chọn lọc các vi sinh vật gây bệnh hay các tế bào ung thư (ở nồng độ thấp:
10
-3
- 10
-2
/ g /ml) mà vẫn đảm bảo an toàn cho người hay động vật được điều trị [4].
* Có giả thiết cho rằng chất kháng sinh là cơ chế giúp cho vi sinh vật tồn tại
trong tự nhiên hoặc cạnh tranh môi trường dinh dưỡng. Cũng có giả thiết lại cho rằng
chất kháng sinh chỉ là sản phẩm thải trong quá trình trao đổi chất của tế bào[5].
Thường các CKS không có chức năng rõ rệt đối với tế bào sản sinh ra chúng. Sự mất
khả năng hình thành CKS không làm
mất khả năng sinh trưởng.
* Bản chất của chất kháng sinh : CKS là nhóm chất rất đa dạng về mặt hóa học,
trọng lượng phân tử biến động trong khoảng 150 - 5000 Dalton. Trong một số kháng


sinh chỉ chứa cacbon (C), hiđrô (H) hoặc thường chứa C, H, O, N, một số khác còn
có S, P, halogen.
Trong phân tử kháng sinh thường chứa các nhóm chức như: hydroxyl (-OH),
cacboxyl (-COOH), cacbonyl (-CO), các nhóm định chức chứa nitơ đồng thời có cấu
trúc đặc trưng của chất hữu cơ (mạch béo, vòng béo, vòng thơm, polipeptit, dị vòng
cacbonhydrat ). Cho đến nay, CKS đều ở thể rắn, có cấu tạo hóa học rất khác nhau
[41], gồm các nhóm sau:
 Nhóm - lactam: chứa hệ thống vòng - lactam, dị vòng phức tạp.
Như Penicillin, Monolactam, Cephalosporin và hàng loạt nấm khác cũng sản sinh ra
CKS chứa hệ thống vòng này.
 Nhóm
aminoglucoside: chứa nhiều các đường amin nối với các đường
amin khác bởi liên kết glucoside, như streptomycin, kanamycin,
gentamycin, neomycin
 Nhóm teracylin: có cấu tạo hóa học vòng naphthalen, gồm
clotetraxyclin, oxytetraxyclin, tetraxyclin có phổ kháng khuẩn lớn.
 Nhóm macrolit: chứa vòng laton lớn nối với aminosacaroza và nhóm
polyen, tiểu biểu là erythromycin.
 Nhóm polipeptit: có cấu tạo gồm các axít amin [41].
* Tùy theo mục đích và phương pháp nghiên cứu, các nhà nghiên cứu đã phân
loại CKS theo nguyên tắc sau:
- Phân loại theo nguồn gốc sinh học của chủng sinh ra chất kháng sinh.
- Phân loại theo phổ kháng sinh.
- Phân loại theo cơ chế tác dụng hay cơ chế sinh tổng hợp ra CKS đó.
- Phân loại theo cấu tạo hóa học.
* Cơ chế t
ác động của kháng sinh lên vi sinh vật [54].
Cơ chế tác động của CKS phụ thuộc vào bản chất hóa học, nồng độ chế phẩm,
cấu trúc hiển vi của tế bào VSV và điều kiện biểu hiện của chúng. Khác với các chất
độc, CKS có tác dụng đặc hiệu, tính đặc hiệu đó gắn kiền với cơ chế tác động. Cơ chế
tác động của CKS có
thể được chia thành các nhóm cơ bản sau:
- Ức chế quá trình tổng hợp của thành tế bào (vỏ) của vi khuẩn. Các nhóm
KS gồm c
ó penicillin, bacitracin, vancomycin. Do tác động lên quá t
rình tổng hợp


thành tế bào nên làm cho

vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp xuất
thẩm thấu.
- Ức chế chức năng họat động của màng tế bào. Các nhóm kháng sinh gồm
có: colistin, polymyxin, gentamicin, amphoterricin. Cơ chế làm mất chức năng của
màng làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài.

- Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein.
CKS thuộc nhóm này gồm nhiều chất như streptom
yxin, erythromixin,
tetraxilin, cloramphenicol gây cản trở tổng hợp prôtêin.
Tác động của một số loại CKS này như sau:
Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome làm
cho quá trình dịch mã không chính xác.
Nhóm
chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme
peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới v
ào chuỗi polypeptide.
Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm
ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide.
- Ức chế q
uá trình tổng hợp acid nucleic.
Các CKS có thể gắn vào axít nuclêic (AND, ARN) tạo thành phức phân tử bất
hoạt, ngăn cản sự sao chép của các axít này.
Nhóm
refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã
tạo thành mRNA (RNA thông tin) .
Nhóm
quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA -gyrase làm cho hai mạch

đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm
ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA.
Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (paminobenzonic acid) có tác dụng
cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid.
Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin
làm
ức chế quá trình tạo acid nuclêic [54].
CKS nhóm
này thì rất độc không những đối với VSV mà còn độc cho người và
các VSV khác [11].
1.1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh.

Xem chi tiết: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN HUYỆN CẦN GIỜ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH