Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với e.coli gây bệnh tiêu chảy trên heo

iv
TÓM TẮT

Enterotoxigenic E. coli là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy phổ biến trên heo
con và heo đang cai sữa, trong khi những hạn chế của kháng sinh trong việc khống chế
E. coli gây bệnh tiêu chảy, thì các chế phẩm sinh học từ Bacillus subtilis chƣa thực sự
hiệu quả trong phòng và trị bệnh. Trong đề tài này chúng tôi phân lập các chủng
Bacillus subtilis trong phân heo có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của E. coli gây
bệnh tiêu chảy trên heo.
Chúng tôi phân lập đƣợc 22 chủng Bacillus subtilis trong phân heo, có 13
chủng tạo đƣợc vòng kháng khuẩn với E. coli, có thể sự tổng hợp của kháng sinh ức
chế sự phát triển của E. coli đƣợc kích thích bởi một nồng độ E. coli đủ lớn, kháng
sinh đƣợc Bacillus subtilis tổng hợp từ giai đoạn rất sớm của sự phát triển ( 0 giờ - 12
giờ ) khi có sự hiện diện của E. coli. Có 5 chủng cho thấy sự ức chế mạnh mẽ E. coli
và nhạy cảm với các loại kháng sinh đƣợc thử nghiệm trừ colistin


v
MỤC LỤC

CHƢƠNG
TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ i
Tóm tắt ii
Mục lục iii
Danh mục các chữ viết tắt iv
Danh sách các hình v
Danh sách các bảng vi
1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích và yêu cầu 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. E. coli gây bệnh tiêu chảy 3
2.2. Enterotoxigenic E. coli 4
2.2.1. Độc tố nhạy nhiệt LT 4
2.2.1.1. Cấu tạo của LT-1 4
2.2.1.2. Cơ chế tác động của độc tố LT-1 4
2.2.2. Độc tố kháng nhiệt 5
2.2.2.1. Độc tố kháng nhiệt STa 5
2.2.2.2. Độc tố kháng nhiệt STb 6
2.2.3. Yếu tố gắn vào thành tế bào ruột của ETEC 7
2.3. Chế phẩm sinh học 9
2.3.1. Định nghĩa 9
2.3.2. Cơ chế tác động 9
2.3.3. Ứng dụng của chế phẩm sinh học 9
2.3.4. Yêu cầu của chế phẩm sinh học 10
2.3.5. Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis 10
2.4. Bacillus subtilis 11
2.4.1. Đặc điểm phân loại 11
2.4.2. Đặc điểm hình thái 11
2.5. Kháng sinh đƣợc tổng hợp bởi Bacillus subtilis 13
2.5.1. Giới thiệu 13
2.5.2. Peptide antibiotic đƣợc tổng hợp bằng ribosome 14
2.5.2.1. Subtilin 14
2.5.2.2. Subtilosin 15
2.5.2.3. Sublancin 16
2.5.2.4. TasA 16
2.5.3. Peptide antibiotic không đƣợc tổng hợp bằng ribosome 18
2.5.3.1. Surfactin 17
2.5.3.2. Fengycin 19
2.5.3.3. Mycosubtilin 29
2.5.3.4. Bacilysocin 20
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

vi
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 22
3.1.1. Thời gian 22
3.1.2. Địa điểm 22
3.2. Vật liệu thí nghiệm 22
3.2.1. Mẫu thí nghiệm 22
3.2.2. Hóa chất 22
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 22
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 22
3.3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo 22
3.3.2. Các phản ứng thử sinh hóa 23
3.3.3. Thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA 24
3.3.4. Đánh giá sự đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSB 24
3.3.5. Thử kháng sinh đồ 24
3.3.6. Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1% 24
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25
4.1. Kết quả 25
4.1.1. Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo 25
4.1.2. Kết quả thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA 27
4.1.3. Kết quả đối kháng trên môi trƣờng TSB 29
4.1.4. Kết quả thử kháng sinh đồ 30
4.1.5. Kết quả đánh giá khả năng phân giải tinh bột 32
4.2. Thảo luận 32
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33
5.1. Kết luận 33
5.2. Đề nghị 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO 34
PHỤ LỤC 39




















vii




DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

ETEC : Enterotoxigenic E. coli
EAEC : Enteroaggregative E. coli
LT : Heat-labile toxin
ST : Heat-stable toxin
CT : Cholera enterotoxin
EAST : Enteroaggreative stable-toxin
ENS : Enteric nervous system
GC-C : Guanylate cyclase C
ABC : ATP-binding cassette


























viii







DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 4.1 : Kết quả phân lập trên môi trƣờng TSA 25
Hình 4.2 : Đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli trên môi trƣờng TSA với nồng
độ pha loãng canh khuẩn E. coli là 10
-2
27
Hình 4.3 : Kết quả kháng sinh đồ 31
Hình 4.4 : Hình phân giải tinh bột của Bacillus subtilis
Biểu đồ 4.1: Biểu đồ biểu hiện sự thay đổi E. coli qua các thời điểm 28



















ix




DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1 : Kết quả độ lớn vòng kháng khuẩn của các chủng Bacillus subtilis phân lập
đƣợc với E. coli ở nồng độ pha loãng là 10-2 trên môi trƣờng TSA 27
Bảng 4.2 : Kết quả số lƣợng CFU/ml của E. coli qua từng khoảng thời gian 0 giờ, 12
giờ, 24 giờ, 36 giờ 29
Bảng 4.3 : Kết quả thử kháng sinh đồ đối với 5 chủng đƣợc thử đối kháng 30
Bảng 4.4 : Kết quả tạo vòng phân giải tinh bột của các chủng Bacillus subtilis phân lập
đƣợc trên môi truờng thạch tinh bột 1% 32

1

1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
2.
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Enterotoxigenic E. coli là vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy phổ biến trong đƣờng
tiêu hóa của heo và ngƣời, chiếm đến 66,7% trƣờng hợp tiêu chảy trên heo còn non và
heo đang cai sữa gây thiệt hại lớn cho ngƣời chăn nuôi.
Do tính chất đề kháng rất nhanh đối với nhiều loại kháng sinh của E. coli, thì
việc sử dụng kháng sinh trở nên kém hiệu quả, đồng thời việc sử dụng kháng sinh dẫn
đến xáo trộn hệ vi sinh vật nội tại và làm xuất hiện ngày càng nhiều những chủng vi
khuẩn đề kháng với kháng sinh gây lo ngại cho ngƣời tiêu dùng, do đó sử dụng
probiotic đƣợc xem nhƣ là một giải pháp thay thế hiệu quả cho kháng sinh. Hiện nay
Bacillus subtilis đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều do có nhiều ƣu điểm thỏa mãn đƣợc
yêu cầu của sản phẩm probiotic hơn so với các chủng vi sinh vật khác. Mặc dù vậy vẫn
chƣa có một sản phẩm probiotic từ Bacillus subtilis có thể ngăn ngừa một cách có hiệu
quả bệnh tiêu chảy. Bên cạnh đó một số sản phẩm probiotic phòng bệnh tiêu chảy trên
thị trƣờng của Việt Nam nhƣ Biosubtyl, Subtyl thì chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng
không phải vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis, đồng thời các chủng này kháng
đƣợc nhiều loại kháng sinh (Ngô Thị Hoa, 2000) nên có khả năng phổ biến các gene
kháng kháng sinh cho các vi khuẩn trong đƣờng ruột của thú. Do đó tiếp tục phân lập
các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng ức chế một cách có hiệu quả vi khuẩn
E. coli gây bệnh tiêu chảy và không mang các gene kháng kháng sinh là điều cần thiết.
Trƣớc tình hình đó đƣợc sự phân công của khoa công nghệ sinh học trƣờng Đại
học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, với sự hƣớng dẫn của Ts. Nguyễn Ngọc Hải
chúng tôi thực hiện đề tài “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và
thử đối kháng với E. coil gây bệnh tiêu chảy trên heo ”.






2


1.2 MỤC ĐÍCH , YÊU CẦU
1.2.1 Mục đích
Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng đối kháng mạnh
với chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo, nhằm phục vụ cho việc ứng
dụng vào trong chăn nuôi.
1.2.2 Yêu cầu
Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ở các hộ nuôi heo
ở Đồng Nai và Bình Dƣơng.
Chọn lọc đƣợc dòng Bacillus subtilis kháng khuẩn đối với E. coli.
Đánh giá sự đối kháng giữa chủng Bacillus subtilis với E. coli gây bệnh trong
môi trƣờng TSB.
Đánh giá sự an toàn về mặt sinh học của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc bằng
phƣơng pháp kháng sinh đồ.
Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1%.












3

3. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4.
2.1 E. coli gây bệnh tiêu chảy
Escherichia coli là vi khuẩn đƣờng ruột gram -, là loài chiếm ƣu thế trong
đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật, hầu hết E. coli là những chủng có lợi giúp cân
bằng hệ thống vi sinh vật đƣờng ruột tuy nhiên có một số chủng có khả năng gây bệnh
cho ngƣời và động vật, trẻ sơ sinh và động vật còn non dễ bị xâm nhiễm bởi những
chủng gây bệnh khi hệ thống vi sinh vật đƣờng ruột bị rối loạn, cơ thể thú bị suy giảm
miễn dịch, hoặc cơ thể thú nhạy cảm với một số chủng vi khuẩn nhất định. Để có thể
gây bệnh các chủng E. coli này cần phải gắn đƣợc vào tế bào thành ruột, tránh sự bảo
vệ của cơ thể vật chủ, gia tăng số lƣợng sau đó làm tổn thƣơng các tế bào thành ruột,
các loại E. coli gây bệnh khác nhau có cơ chế gây bệnh khác nhau, do đó dựa vào sự
tƣơng tác của E. coli với tế bào thành ruột có thể chia các chủng E. coli gây bệnh thành
ít nhất 6 loại: enterotoxigenic E. coli (ETEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC),
enteroaggregative E. coli (EAEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), enteroinvasive E.
coli (EIEC), diffusely adherent E. coli (DAEC) (12).
Các chủng E. coli gây bệnh còn đƣợc phân biệt với nhau bằng các phản ứng
ngƣng kết kháng nguyên.
Sự xâm nhiễm của các chủng E. coli gây bệnh dẫn đến các rối loạn trong hệ
thống tiêu hóa, nhiễm trùng đƣờng tiết niệu, rối loạn hệ thần kinh trung ƣơng, sau khi
cố định trên tế bào thành ruột các chủng E. coli này tiết ra độc tố làm tổn thƣơng các tế
bào thành ruột, tất cả những gene qui định độc tính của vi khuẩn đƣợc mã hóa trên
cùng plasmid hoặc đƣợc tập trung trong một vùng nhiễm sắc thể của bộ gene vi khuẩn,
có một vài tính trạng riêng biệt đƣợc mã hóa trên transposome hay phage.
Trong 6 loại trên thì enterotoxigenic E. coli là loại phổ biến nhất gây bệnh trên
heo.
2.2 Enterotoxigenic E. coli (ETEC)
Enterotoxigenic E. coli là những chủng vi khuẩn có khả năng tiết ra ít nhất là
một thành viên trong trong 2 loại độc tố enterotoxin là: LT (heat-labile toxin), ST
(heat-stable toxin). ETEC có khả năng gây ra hiện tƣợng tiêu chảy trên heo, trên ngƣời
và các loài thú khác. Mỗi chủng ETEC có thể mang gene mã hóa cho 1 loại độc tố
4

hoặc có thể cả 2 loại độc tố khác nhau, những gene này có khả năng cùng đƣợc biểu
hiện và gây bệnh cho tế bào vật chủ, trong đó thì LT có ảnh hƣởng rất lớn đối với độc
tính của vi khuẩn (11).
2.2.1 Độc tố nhạy nhiệt LT
LT là độc tố nhạy cảm với nhiệt có cấu trúc và cơ chế gây độc gần giống với
cholera enterotoxin (CT) đƣợc sản xuất từ Vibrio cholerae, gene mã hóa cho cấu trúc
của độc tố LT nằm trên plasmid có nguồn gốc từ vi khuẩn Vibrio cholerae. LT có hai
nhóm chính là LT-1 và LT-2, hai độc tố này không cho đáp ứng miễn dịch chéo với
nhau. LT-1 đƣợc biểu hiện trong các chủng E. coli gây bệnh trên ngƣời và động vật
còn LT-2 chỉ đƣợc tìm thấy trên những chủng E. coli phân lập đƣợc trên động vật và
một số rất ít chủng phân lập đƣợc trên ngƣời tuy nhiên không có bằng chứng cho thấy
LT-2 có khả năng gây bệnh do đó cơ chế tác động của độc tố LT tập chung chủ yếu
vào LT-1.
2.2.1.1 Cấu tạo của LT-1
LT1-1 trọng lƣợng phân tử là 86 kDa đƣợc cấu tạo từ 1 tiểu đơn vị A có trọng
lƣợng phân tử 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B có trọng lƣợng phân tử 11,5 kDa, 5 tiểu đơn
vị B sẽ gắn vào các thụ thể trên tế bào ruột còn tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tự
phân cắt thành 2 tiểu đơn vị là A1 và A2 nối với nhau bằng cầu nối disulfic, LT-1 có
hai loại là LTh-1 có độc tính trên ngƣời và LTp-1 có độc tính trên heo.
2.2.1.2 Cơ chế tác động của độc tố LT-1
Sau khi gắn vào màng tế bào chủ LT-1 đƣợc chuyển vào trong tế bào, mục tiêu
của LT-1 là adenylate cyclase, enzyme này nằm trên lớp màng phân cực của tế bào
biểu mô ruột. Tiểu đơn vị A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase hoạt động chuyển
ADP từ NAD gắn vào tiểu đơn vị alpha của protein liên kết với GTP làm hoạt hóa hoạt
tính adenylate cyclase của tiểu đơn vị này, quá trình gắn ADP vào tiểu đơn vị làm
adenylate cyclase hoạt động liên tục từ đó gia tăng hàm lƣợng cAMP nội bào, khi hàm
lƣợng cAMP nội bào tăng, cAMP sẽ gắn vào và hoạt hóa enzyme protein kinase A,
enzyme này hoạt động làm phosphoryl hóa kênh clorua nằm ở phía trên màng tế bào
biểu mô ruột, sự phosphoryl hóa dẫn đến sự gia tăng hoạt động của kênh do đó ion
clorua sẽ bị tiết ra ngoài qua các khe tiết đồng thời ức chế sự hấp thụ NaCl từ bên
ngoài vào bởi các tế bào lông ruột, do đó tăng nồng độ ion trong ruột làm nƣớc bên

Xem chi tiết: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với e.coli gây bệnh tiêu chảy trên heo